培养基

培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素。
 

按所用原料不同，可分为两类：应用肉汤、马铃薯汁等天然成分配制的，称为天然培养基；应用化学药品配成并标明成分的，称为合成培养基或综合培养基。化学试剂中的培养基，大多为合成培养基。由于液体培养基不易长期保管，现在均改制成粉末。培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后，易被细*污染或分解变质，因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基（如组织培养基），较长时间的贮存，必须放在2~6。C的冰箱内。
 

常见培养基有：
 

1、细*培养基 
 

配方一 牛肉膏琼脂培养基 
 

牛肉膏0.3克 ，蛋白胨1.0克，氯化钠 0.5克，琼脂 1.5克， 
 

水 100毫升 
 

在烧杯内加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，用蜡笔在烧杯外作上记号后，放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后，加入琼脂，不断搅拌以免粘底。等琼脂完全溶解后补足失水，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到7.2～7.6,分装在各个试管里，加棉花塞，用高压蒸汽灭菌30分钟。 
 

配方二 马铃薯培养基 
 

取新鲜牛心（除去脂肪和血管）250克，用刀细细剁成肉末后，加入500毫升蒸馏水和5克蛋白胨。在烧杯上做好记号，煮沸，转用文火炖2小时。过滤，滤出的肉末干燥处理，滤液pH值调到7.5左右。每支试管内加入10毫升肉汤和少量碎末状的干牛心，灭菌，备用。 
 

配方三 根瘤菌培养基 
 

葡萄糖 10克 磷酸氢二钾 0.5克 
 

碳酸钙 3克 硫酸镁 0.2克 
 

酵母粉 0.4克 琼脂 20克 
 

水 1000毫升 1%结晶紫溶液 1毫升 
 

先把琼脂加水煮沸溶解，然后分别加入其他组分，搅拌使溶解后，分装，灭菌，备用。 
 

2、放线菌培养基 
 

配方一 淀粉琼脂培养基（高氏培养基） 
 

可溶性淀粉 2克 硝酸钾 0.1克 
 

磷酸氢二钾 0.05克 氯化钠 0.05克 
 

硫酸镁 0.05克 硫酸亚铁 0.001克 
 

琼脂 2克 水 100毫升 
 

先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到7.2～7.4，分装后灭菌，备用。 
 

配方二 面粉琼脂培养基 
 

面粉 60克 琼脂 20克 
 

水 1000毫升 
 

把面粉用水调成糊状，加水到500毫升，放在文火上煮30分钟。另取500毫升水，放入琼脂，加热煮沸到溶解后，把两液调匀，补充水分，调整pH值到7.4，分装，灭菌，备用。 
 

3、真*培养基 
 

配方一 萨市（Sabouraud’s）培养基 
 

蛋白胨 10克 琼脂 20克 
 

麦芽糖 40克 水 1000毫升 
 

先把蛋白胨、琼脂加水后，加热，不断搅拌，待琼脂溶解后，加入40克麦芽糖（或葡萄糖），搅拌，使它溶解，然后分装，灭菌，备用。 
 

本培养菌是培养许多种类真*所常用的。 
 

配方二 马铃薯糖琼脂培养基 
 

把马铃薯洗净去皮，取200克切成小块，加水1000毫升，煮沸半小时后，补足水分。在滤液中加入10克琼脂，煮沸溶解后加糖20克（用于培养霉菌的加入蔗糖，用于培养酵母菌的加入葡萄糖），补足水分，分装，灭菌，备用。 
 

把这培养基的pH值调到7.2～7.4，配方中的糖，如用葡萄糖还可用来培养放线菌和芽孢杆菌。 
 

配方三 黄豆芽汁培养基 
 

黄豆芽 100克 琼脂 15克 
 

葡萄糖 20克 水 1000毫升 
 

洗净黄豆芽，加水煮沸30分钟。用纱布过滤，滤液中加入琼脂，加热溶解后放入糖，搅拌使它溶解，补足水分到1000毫升，分装，灭菌，备用。 
 

把这培养基的pH值调到7.2～7.4，可用来培养细*和放线菌。 
 

配方四 豌豆琼脂培养基 
 

豌豆 80粒 琼脂 5克 
 

水 200毫升 
 

取80粒干豌豆加水，煮沸1小时，用纱布过滤后，在滤液中加入琼脂，煮沸到溶解，分装，灭菌，备用。 
 

4、食用菌菌种培养基 
 

配方一 马铃薯—蔗糖--琼脂培养基 
 

20%马铃薯煮汁 1000毫升 
 

蔗糖 20克 琼脂 18克 
 

把马铃薯洗净去皮后，切成小块。称取马铃薯小块200克，加水1000毫升，煮沸20分钟后，过滤。在滤汁中补足水分到1000毫升，即成20%马铃薯煮汁。在马铃薯煮汁中加入琼脂和蔗糖，煮沸，使它溶解后，补足水分，分装，灭菌，备用。使用该培养基对pH值要求不严格，可以不测定。 
 

配方二 综合马铃薯培养基 
 

20%马铃薯煮汁 1000 毫升
 

磷酸二氢钾 3克 硫酸镁 1.5克 
 

葡萄糖 20克 维生素 10毫克 
 

琼脂 18克 
 

先配制20%马铃薯煮汁，方法同上。在煮汁中加入上述各种组分，加热溶解后补足水分，调整pH值到6。分装，灭菌，备用。 该培养基用于培养和保存灵芝、平菇、香菇等食用菌菌种。 
 

5.烟草的培养基
 

在植物组织培养时,通过调节IAA和CTK的比值能影响愈伤组织分化出根或芽.CTK/IAA高时,愈伤组织分化芽
 

CTK/IAA低时,分化根;CTK/IAA比例适中维持愈伤组织不分化 
 

愈伤组织诱导培养基制备 
 

以MS培养基母液为基础,向洁净铝锅中顺序加入大量元素20×母液100mL,微量元素100×母液20mL,铁盐100×母液20mL ,维生素100×母液20mL,肌醇200×母液10mL,甘氨酸200×母液10mL,配制得MS培养基后,再加入0.5mg·L-1的BA8mL,0.5mg·L-1的NAA8mL.然后加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水,加入40g蔗糖后搅拌使其溶化,用0.5mol·L-1的NaOH和0.5 mol·L-1的HCl调整pH值*5.8-6.0.加入14g琼脂,将铝锅置于电炉上,搅拌加热使琼脂完全溶化,然后用蒸馏水定容*终体积2L,继续加热几分钟使之混合均匀后分装于三角瓶中. 
 

烟草叶片愈伤组织诱导 
 

取一无菌培养皿,用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中,并用解 
 

剖刀将叶片切成2mm2左右的小片,然后将其接种于准备好的培养基上,每瓶接种 
 

5小片,一共接种6瓶.接种后的三角平置于24条件下黑暗培养1周,然后在同 
 

样温度下有光照和全黑暗下培养3周直*愈伤组织形成(两种情况各置3瓶).观 
 

察愈伤组织诱导结果,统计愈伤组织诱导率. 
 

器官分化及植株再生培养 
 

将诱导的愈伤组织按类型分别转入分化培养基上,置于连续光照,温度20-22 C条件下培养3周,统计愈伤组织再生植株情况. 
 

愈伤组织诱导的总体情况 
 

烟草愈伤组织诱导培养4周后,愈伤组织基本形成,即排除因生长时间不够而 
 

未形成愈伤的情况.具体情况见表一中所示,6瓶培养物均有愈伤形成,且都未发 
 

生污染,但诱导率几乎各不相同.其中, 在光照条件下培养的3瓶平均愈伤诱导率为 
 

60.0℅, 在黑暗条件下培养的3瓶平均愈伤诱导率为46.7%.由于实验过程中,外植 
 

体即烟草叶片取得偏小,接种时可能已有部分外植体的大部分细胞脱水死亡,使整 
 

个实验的愈伤组织诱导率偏低,愈伤块偏小. 
 

培养基还有:1640培养基
 

特殊培养基：
 

一 选择性培养基 
 

1酵母菌富集培养基 
 

葡萄糖5% 尿素0.1% 硫化铵0.1% 磷酸二氢钾0.25% 磷酸氢二钠0.05% 七水合硫酸镁0.1% 七水合硫酸铁0.01% 酵母膏0.05% 
 

孟加拉红0.003% pH4.5 
 

2 Ashby无氮培养基 富集好养自生固氮菌 
 

甘露醇1% 磷酸二氢钾0.02% 七水合硫酸镁0.02% 氯化钠0.02% 
 

二水合硫酸钙0.01% 碳酸钙0.5% 
 

二 鉴别培养基 
 

EMB培养基，常用于鉴别E.coli 
 

蛋白胨 10g 乳糖5g 蔗糖5g 磷酸氢二钾2g 伊红Y 0.4g 美蓝0.065g 
 

蒸馏水1000g pH7.2 
 

分离海洋微生物的培养基配方 
 

2216E培养基配方（固体培养基） 
 

蛋白胨 5克 
 

酵母膏 1克 
 

磷酸高铁 0.01克 
 

琼脂 15-----20克 
 

陈海水 1000毫升 
 

煮沸氢氧化纳（5%）的溶液调PH值7.6—7.8 
 

其他培养基：
 

1.高氏一号培养基
 

KNO3:1g, 
 

NaCl:0.5g,
 

K2HPO4:0.5g
 

MgSO4·7H2O：0.5g
 

FeSO4·7H2O：0.01g
 

可溶性淀粉20g
 

琼脂20g
 

蒸馏水1000ml
 

pH调*7.2~7.4，121°C灭菌30min
 

制法：先用少量水将淀粉调成糊状，再取700ml水在电炉上加热煮沸
 

然后边搅拌便将淀粉糊倒入，同时保持沸腾。然后再将其他成分加入，
 

溶解后补足水分*1000ml
 

肉汤蛋白胨斜面：
 

蛋白胨10g
 

牛肉膏5g
 

蒸馏水1000ml
 

NaCl：5g
 

pH：7.0~7.2，121℃灭菌20min
 

如配制固体培养基需加琼脂1.5%~2%,半固体培养基可加琼脂0.5%~0.8%
 

不同的细胞培养基
 

天然细胞培养基
 

天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴*、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期，体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。
 

血清种类
 

目前用于组织培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因：来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的，但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。 
 

牛血清是细胞培养中用量*大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。显然，胎牛血清是品质*高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分*少。 
 

血清的主要成分
 

血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激*、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。
 

血清主要作用
 

1. 提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。
 

2. 提供激*和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激*（氢化可的松、地塞米松）、类固醇激*（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。
 

3. 提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激*等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。 
 

4. 提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。 
 

5. 对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。这种作用是偶然发现的，现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。 
 

血清培养基主要问题
 

1. 血清的成份可能有几百种之多，目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是对其中一些多肽类生长因子、激*和脂类等尚未充分认识，这给研究工作带来许多困难。 
 

2. 血清都是批量生产，各批量之间差异很大，而且血清保存期*多一年，因此，要保证每批血清的相似性极为困难，从而使实验的标准化和连续性受到限制。
 

3. 对大多数细胞，在体内状态，血清不是它们接触的生理学液体，只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清，因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态，血清可能促进某些细胞的生长（成纤维细胞）同时抑制另一类细胞生长（表皮细胞）。 
 

4. 血清含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应（如精胺、亚精胺）形成有细胞毒性作用的聚精胺。补体、抗体、细*毒素等都会影响细胞生长，甚*造成细胞死亡。 
 

5. 动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致。 
 

6. 取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性。 
 

7. 大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之*。 
 

血清的质量标准
 

血清质量高低取决于两方面因素：一是取材对象，二是取材过程。用于取材的动物应健康无病并且在指定的出生天数之内，取材过程应严格按照操作规程执行，制备出的血清要经过严格的质量鉴定。WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求：
 

1. 牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家。并应具备适当的监测系统。
 

2. 有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。
 

3. 证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。 
 

4. 血清要通过滤膜过滤除菌，保证无菌。 
 

5. 无细*、霉菌、支原体和病毒的污染，有些国家要求无细*噬菌体污染。 
 

6. 对细胞有良好的支持繁殖作用。 
 

我国在对牛血清的质量2000年版《中国生物制品主要原辅料质控标准》中提出比较严格的标准要求。包括蛋白质含量，细*、真*、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细*内毒素，支持细胞增*检查。