宁波欧曼生物科技有限公司合成DTT技术

二硫苏糖醇（DTT）——一种特效还原剂

一、概述

二硫苏糖醇（Dithiothreitol，简称为DTT）是一种小分子有机还原剂，化学式为C4H10O2S2。其还原状态下为线性分子，被氧化后变为包含二硫键的六元环状结构。二硫苏糖醇的名字衍生自苏糖（一种四碳单糖）。DTT的异构体为二硫赤糖醇（DTE），即DTT的C3-差向异构体。

DTT是一种很强的还原剂，其还原性很大程度上是由于其氧化状态六元环（含二硫键）的构象稳定性。它的氧化还原电势在pH为7时为-0.33伏。二硫苏糖醇对一个典型的二硫键的还原是由两步连续的巯基-二硫键交换反应所组成：

其中，第*步反应所形成的中间态很不稳定，因为DTT上的第二个巯基趋向于与被氧化的硫原子连接，使中间态很快被转化为DTT的环状氧化结构，从而完成对二硫键的还原。

DTT的还原力受pH值的影响，只在pH值大于7的情况下能够发挥还原作用。这是因为只有脱去质子的硫醇盐负离子（-S–）才具有反应活性，硫醇（-SH）则没有；而巯基的PKa一般为～8.3。

由于容易被空气氧化，因此DTT的稳定性较差；但冷冻保存或在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命。由于质子化的硫的亲核性较低，随着pH值的降低，DTT的有效还原性也随之降低。

二、合成方法

（1）以1,3-丁二烯为原料，经溴化、氧化、乙酰化后与硫代乙酸钾反应后经甲醇氯化氢溶液作用而得，如图所示。

 此方法步骤较多，工艺路线长，操作工序复杂，导致整体收率不高。原料也用到了气味较大的硫代乙酸钾，对环境会有一定的影响。

（2） Whitesides等[1]用1,2:3,4-二环氧丁烷为起始原料，经过硫代乙酸开环后，再经水解步骤而得，如图所示。

此法步骤虽少，但是反应体系中异构体较多，导致分离效率低下，*终收率也很低。且硫代乙酸的污染也相对较大。

（3）以苏藓糖醇为原料，先用高锰酸钾氧化，再在硫代乙酸作用下得到硫代中间体，*后水解该硫代中间体得到DTT。该方法的缺陷在于：在生成硫代中间体的同时，会生成一个DTT的同分异构体杂质，该杂质的理化性质和DTT极为相近，从而导致DTT分离提纯困难，产率低，生产成本昂贵，仅适用于实验室合成，不适用于工业化生产。

（4），公开了一种二硫苏糖醇的合成方法，即以1,4-丁烯二醇为起始原料，先与溴进行加成反应，制得2,3-二溴-1,4-丁二醇；再在碱催化下水解，制得二环氧乙烷；再与硫代乙酸进行加成反应，制得二硫苏糖醇二乙酸酯；*后在碱催化下水解，制得二硫苏糖醇。

此发明方法与Whitesides等的方案有相似之处，缺点也相近。

（5）发明了一种二硫苏糖醇的制备方法。a)酒石酸二甲酯与丙酮缩二甲醇混合物在酸催化下、在有机媒介中反应，得到2,3‑O‑异亚丙基酒石酸二甲酯化合物。(b) 将步骤(a)所述的2,3‑O‑异亚丙基酒石酸二甲酯化合物与硼氢化钠在甲醇中反应，得到2,3‑O‑异亚丙基苏醇化合物。 (c) 将步骤(b)所述的2,3‑O‑异亚丙基苏醇化合物与磺酰氯在碱作用下反应，得到2,3‑O‑异亚丙基苏醇磺酸酯化合物。(d) 将步骤(c)所述的2,3‑O‑异亚丙基苏醇磺酸酯与硫代乙酸盐在有机溶剂中反应，得到2,3‑O‑异亚丙基二硫苏糖醇二乙酸酯。(e) 将步骤(d)所述的2,3‑O‑异亚丙基二硫苏糖醇二乙酸酯化合物在碱性体系中水解，得到目标化合物二硫苏糖醇。

该方法具有操作简便、收率高、纯度高、易于工业化生产等特点。但是步骤较多，操作不简便。

（6）中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所的江幼岷、赵忠等[4]提供了一条简便合成方法。以4,5-二羟基-1,2-二硫环己烷为原料电解而成。以汞、铜、铅等金属板为阴极，碳棒为阳极，盐酸为电解液。电解完毕后用乙醚提取阴极液，回收乙醚得到1,4-二硫代苏糖醇。本法制备1,4-二硫代苏糖醇有以下优点：合成方法简便，避免使用硫代乙酸钾或硫化氢试剂。用电解还原将4,5-二羟基-1,2-二硫环己烷还原成1,4-二硫代苏糖醇，容易进行，收率可达到75%左右。副产物少，不需要真空蒸馏和重结晶处理就能达到纯度要求。

此方法思路新颖，所涉及的原料较少，也比较清洁，但是4,5-二羟基-1,2-二硫环己烷不易获得，方案的可操作性不强，装置的一次性投入费用较高，并不具有普遍性。

三、应用

DTT的用途之*是作为巯基化DNA的还原剂和去保护剂。巯基化DNA末端硫原子在溶液中趋向于形成二聚体，特别是在存在氧气的情况下。这种二聚化大大降低了一些偶联反应实验（如DNA在生物感应器中的固定）的效率；而在DNA溶液中加入DTT，反应一段时间后除去，就可以降低DNA的二聚化。

DTT也常常被用于蛋白质中双硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间双硫键。但DTT往往无法还原包埋于蛋白质结构内部（溶剂不可及）的双硫键，这类双硫键的还原常常需要先将蛋白质变性（高温加热或加入变性剂，如6M盐酸胍、8M尿素或1%SDS）。反之，根据DTT存在情况下，双硫键还原速度的不同，可以判断其包埋程度的深浅。

另外二硫苏糖醇在各行各业中还有着更加广泛的应用。

马保亮等[5]研究了二硫苏糖醇对乳球蛋白淀粉样纤维形成的影响，淀粉样纤维与老年痴呆症、帕金森病和非神经性组织淀粉样变性病等人类疾病相关。运用ThT荧光、刚果红结合和透射电镜的方法研究了还原剂二硫苏糖醇对乳球蛋白淀粉样纤维形成的影响。实验结果表明：当乳球蛋白在中性条件和5M尿素中培养时，乳球蛋白会形成淀粉样纤维。然而当在溶液中加入二硫苏糖醇时，其淀粉样纤维的形成会受到抑制，并且这种抑制能力依赖于二硫苏糖醇的浓度。这些结果表明，二硫键在乳球蛋白淀粉样纤维形成过程中起着非常关键的作用。

罗轩等[6]探讨二硫苏糖醇（DTT）诱导大鼠正常肝细胞株BRL-3A发生内质网应激时细胞内葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、钙蛋白酶2（calpain-2)、caspase-12及caspase-3的表达变化及对细胞凋亡的影响。方法：采用2.5mmol/LDTT分别处理BRL-3A细胞12h和24h，应用real-timePCR检测细胞内GRP78、calpain-2、caspase-12及caspase-3的mRNA水平；采用细胞免疫荧光检测细胞内GRP78、calpain-2、caspase-12及caspase-3的蛋白表达；应用Westernblot检测cleavedcaspase-12及cleaved caspase-3的表达变化；采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果：BRL-3A细胞经DTT处理12h及24h后，GRP78、calpain-2及caspase-12的mRNA表达较正常对照组显著升高(P<0.01)，而caspase-3的mRNA水平与正常对照组比较无显著变化；细胞免疫荧光及Westernblot检测发现，DTT处理细胞12h及24h后，BRL-3A细胞内GRP78、calpain-2、caspase-12及caspase-3的蛋白表达均较正常对照组显著增高，同时，cleavedcaspase-12及cleavedcaspase-3的表达也较正常对照组明显增多(P<0.05)；流式细胞术检测发现，经DTT处理后BRL-3A细胞的凋亡率较正常对照组显著增加（P<0.05)。结论：二硫苏糖醇诱导BRL-3A细胞凋亡可能与calpain-2/caspase-12信号通路激活有关。

陈新斌等[7]以耐海水菠菜品种‘荷兰3号’为材料，采用水培方法，研究了二硫苏糖醇（DTT）对海水胁迫及甲基紫精（MV）诱导下菠菜活性氧代谢及叶绿素荧光特性的影响。结果表明，海水胁迫与MV处理一样，诱导菠菜叶片产生氧化胁迫，使超氧阴离子（噶）产生速率、过氧化氢（H2O2）含量和丙二醛（MDA）含量显著上升，叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量显著下降，*大光量子产量（Fv/Fm）、实际光量子产量（Yield）、电子传递速率（ETR）和光化学猝灭系数（qP）显著降低，而非光化学猝灭系数（NPQ/4）显著上升；海水胁迫与MV处理下，由叶柄导入叶黄素循环活性抑制剂DTT，菠菜叶片活性氧（ROS）大量积累，导致光合色素降解加剧，Fv/Fm、Yield、ETR、NPQ、qP进一步下降。上述结果表明，海水胁迫抑制了菠菜叶片叶黄素循环活性，降低了叶片非辐射能量耗散能力，加重了叶片ROS积累，从而导致光合色素含量降低，PSⅡ活性下降，电子传递速率降低，用于光化学反应的能量部分减少，光合作用受到严重影响，说明海水胁迫下叶黄素循环在保持菠菜叶片光合色素稳定和光合作用正常运转中发挥重要作用。

李玉玲等[8]建立了一种在前处理过程中使用二硫苏糖醇(DTT)为还原剂，反相高效液相色谱法检测奶粉中含硫氨基酸的方法。方法：奶粉经酸法水解后，加入二硫苏糖醇对水解液进行还原处理,用反相高效液相色谱法检测奶粉中含硫氨基酸，对还原条件、色谱分离条件进行优化,确定*佳检测条件。结果：蛋氨酸(Met)、胱氨酸[(Cys)2]、半胱氨酸(Cys)检测限分别为0.7μmol/L、0.3μmol/L、0.5μmol/L，定量检测范围均为10～750 tmol/L，相关系数分别为0.9998、0.9999、0.9991。*佳DTT作用条件为向1 mL水解液中加入100μL0.1 mol/L DTT溶液，室温反应1h。测得奶粉中Met、(Cys)2含量分别为0.37g/100 g、0.14 g/100 g，加标回收率均在82％～87％之间，相对标准偏差(RSD)≤1.5％。结论：在前处理过程中使用适量DTT做还原剂，用反向高效液相色谱法可准确检测奶粉中含硫氨基酸的含量。

王杰等[9]为了抑制锂硫电池的穿梭效应，改善锂硫电池的电化学性能，尝试以二硫苏糖醇(DTT)为剪切剂，对高阶多硫化物进行剪切以阻止其溶解。将二硫苏糖醇(DTT)掺入多壁碳纳米管(MWCNTs)纸中，制得DTT夹层，将该DTT夹层置于锂硫扣式半电池正极片和隔膜之间，正极片的载硫面密度约为2 mg/cm2。SEM观察结果证实DTT均匀分散在MWCNTs纸的表面和空隙中。电化学测试结果表明引入DTT夹层结构的锂硫电池在0.05C倍率首*放电比容量达到1288 mAh/g，首*库伦效率接近100%，在0.5C、2C、4C倍率下充放电时的比容量分别达到650 mAh/g、600 mAh/g、410 mAh/g。DTT夹层结构的引入可有效剪切高阶多硫化物并阻止其迁移到锂负极，从而抑制穿梭效应，改善锂硫电池的循环稳定性和库伦效率。

张曼曼等[10]基于DTT法测量广州市区PM2.5的氧化潜势。大气颗粒物氧化潜势（Oxidative potential）常用于表征颗粒物对人体健康的影响。二硫苏糖醇（DTT）法是近年发展的一种测定颗粒物氧化潜势的方法，本研究改进了该方法的颗粒物提取方式和反应流程，并开展了广州市区PM2.5氧化潜势（DTTm&DTTv）的测量。结果表明，广州市区2018年1月和4月PM2.5的DTTm值分别为（13.47±3.86），（14.66±4.49） pmol/（min·μg），DTTv值分别为（4.67±1.06），（4.45±1.02） nmol/（min·m3），与国内外研究结果相当。

DTT还能够保护正常晶体蛋白所含的半胱氨酸等成分不受氧化修饰，减少其变性可能性；还能够使已发生聚集的晶体蛋白发生分子之间的二硫键解离，阻止晶体蛋白高分子聚合物的形成，进而阻止其晶体蛋白由水溶性变为水不溶性，亦即抑制了晶体的混浊乃*白内障的发生；与其他抗氧化、抗糖化、抗游离基等成分合用，能够发挥良性协同效应。

一些世界知名公司也用DTT进行了一系列卓*成效的实验。

比如赛默飞世尔科技为了研究端粒酶受Wnt/beta-catenin信号调控，采用了DTT进行免疫沉淀实验；为了研究HIV的中和抗体经过演化而识别病毒的保守结构，采用DTT进行细胞裂解实验[11]。

西格玛奥德里奇为了研究Vav2和Vav3蛋白在皮肤癌中的作用，二硫苏糖醇被用于进行细胞培养实验[12]；为了研究卵细胞产生过程受MARF1调控，采用了DTT进行卵母细胞裂解实验；为了利用cIAP1的自身泛素化能够被拮抗剂诱导的cIAP1的构象改变所促进，采用DTT进行cIAP1降解产物测序实验；为了研究小鼠胚胎在植入子宫前5hmC的清除是一个依赖于DNA复制的被动过程，采用DTT以3mM浓度进行有丝分裂染色体分析实验。

Illumina公司为了研究深海中的几种细*被发现属于化能无机自养型生物，采用DTT以2 mM浓度进行多重置换扩增实验[13]。

综上所述，二硫苏糖醇不仅在蛋白质生化领域有着突出的应用优势，其在病理学研究、食品安全与监测、环境科学、高端材料等领域也有着令人瞩目的表现。我们深信，随着科技的发展，不断的积累，DTT的应用潜力会被逐步挖掘，市场需求空间将会越来越广。